Ambroży z Mediolanu urodził w roku 339 w Trewirze. W tamtym czasie była to stolica Cesarstwa Rzymskiego i siedziba cesarza Konstantyna II. Pochodził z arystokratycznej, zamożnej rodziny. Ojciec jego był namiestnikiem cesarskim, prefektem Galii. Ambroży miał dwoje starszego rodzeństwa: siostrę Marcelinę (świętą, konsekrowaną dziewicę) oraz brata Uraniusza Satyra również świętego Kościoła katolickiego. Podanie głosi, że rój pszczół usiadł na ustach jego jako niemowlęcia, matka chciała go odegnać, ale ojciec jego nakazał poczekać, aż rój sam odleci. Poczytano to za znak, iż będzie kimś wielkim.
Mając zaledwie rok zostaje osierocony przez ojca i matka razem z dziećmi przenosi się do Rzymu. W tym mieście chodził do szkoły i uczył się gramatyki oraz wymowy równocześnie poznając prawo. Już jako uczeń dał się poznać jako wspaniały mówca oraz bystry i energiczny człowiek. Około roku 370 zostaje mianowany gubernatorem prowincji Liguria i Emilia z siedzibą w Mediolanie. Miasto to do 402 roku pełniło rolę stolicy cesarstwa zachodniorzymskiego. W czasie swoich rządów uporządkował prowincję oraz jej finanse.
W roku 373 zmarł ariański biskup miasta i wybór jego następcy zrodził gwałtowny spór. Katolicy chcieli swojego kandydata a arianie swojego.
Arianizm odrzucał naukę o Trójcy Świętej jak również bóstwo Jezusa Chrystusa. Nauczanie to zostało potępione przez sobór nicejski w 325 roku oraz pierwszy sobór konstantynopolitański w 381 roku.
Ambroży z uwagi na pełniony urząd, by zapobiec ewentualnym rozruchom, udał się do kościoła gdzie miano wybrać następcę zmarłego biskupa Auksencjusza. Gdy obie strony nie mogły osiągnąć porozumienia jakieś dziecię zawołało głośno: „Ambroży biskupem!”. Zgromadzeni uznali to za głos Boży i chórem powtórzyli okrzyk: „Ambroży biskupem”. Prosząc o czas do namysłu skorzystał z okazji by uciec z miasta. Nocna ucieczka zakończyła się u bram Mediolanu – co Ambroży odczytał jako wolę Bożą i postanowił poddać się temu wyborowi. Do objęcia urzędu potrzebny był jeszcze chrzest oraz święcenia. W IV wieku z chrztem czekano do czasu osiągnięcia wieku dorosłego. Ambroży był tylko katechumenem (osoba przygotowująca się do chrztu, które mogło trwać parę lat). Dnia 7 grudnia 373 roku Ambroży został biskupem Mediolanu.
Św. Ambroży starał się by wiara katolicka była elementem łączącym w imperium, by Kościół i władza świecka współpracowały ze sobą. Współpraca ta miała mieć jasne i określone zasady. Jak to sam określił w kazaniu: „Bo cesarz jest w Kościele, a nie ponad Kościołem. Dobry bowiem cesarz stara się nieść pomoc Kościołowi, a nie zwalczać go”. Dzięki niemu cesarz Gracjan w roku 380 wydał dekret uznający religię katolicką za jedyną religię państwową. W 382 roku ten sam cesarz usunął z budynku senatu rzymskiego posąg bogini Wiktorii. Ambroży był nieubłaganym wrogiem arian i nie zawahał się wejść w konflikt z matką cesarza Walentyniana II, Justyną popierającą tę herezję. Płomienne kazania głoszone przez Ambrożego były słuchane przez Augustyna (święty, Doktor i Ojciec Kościoła, biskup, filozof i teolog), który pod wpływem nauczania biskupa Mediolanu nawrócił się i przyjął chrzest w 387 roku z jego rąk.
Biskup Ambroży zwracał wielką uwagę na liturgię w Kościele. Od jego imienia pochodzi nazwa rytu ambrozjańskiego w Kościele katolickim, który funkcjonuje do dziś w diecezji mediolańskiej oraz we włoskojęzycznej części Szwajcarii. Był rozważnym i wrażliwym na krzywdę ludzką, odznaczał się silną wolą, poczuciem ładu i zmysłem praktycznym. Był nazywany: „kolumną Kościoła” oraz „perłą, która błyszczy na palcu Boga”. Głosił porywające kazania dla wiernych, uważając nauczanie ludu za swój podstawowy pasterski obowiązek. Aby mieć odpowiednio przygotowanych współpracowników w diecezji założył seminarium-klasztor dla przyszłych kapłanów. Sam nadał im regułę i często wśród nich przebywał.
Ambroży z Mediolanu był również twórcą śpiewu liturgicznego nazywanego chorałem ambrozjańskim lub śpiewem mediolańskim. Śpiewy te są źródłem i podstawą do powstania chorału gregoriańskiego – najpiękniejszej rzeczy po tej stronie nieba.
Święty Ambroży w imię wartości chrześcijańskich napomniał cesarza Teodozjusza i zażądał odprawienia pokuty za okrutne wymordowanie 7 tysięcy mieszkańców Tessalonik. Pokuta odprawiana była publicznie i trwała osiem miesięcy. Gdy cesarz chciał zająć miejsce w prezbiterium, jak to czynił w Konstantynopolu, Ambroży nie zgodził się mówiąc: „Purpura jest oznaką cesarza, nie kapłana”. Później, gdy poproszono cesarza by zasiadł w prezbiterium odrzekł: „Za późno poznałem, jaka zachodzi różnica między biskupem a cesarzem. Zawsze otoczony pochlebcami, teraz dopiero poznałem męża, który śmiał mi otwarcie powiedzieć prawdę. Jednego tylko znam, co godzien być biskupem, a jest nim Ambroży”. Cesarz Teodozjusz cenił Ambrożego, z jego rąk przyjął ostatnie namaszczenie i zmarł w jego ramionach.
Św. Ambroży, biskup Mediolanu zmarł 4 kwietnia 397 roku w Wielki Piątek w drodze na antyariański synod w Capui. Wspomnienie liturgiczne zaczęto obchodzić nie w dniu narodzin dla nieba ale w dniu przyjęcia święceń biskupich – 7 grudnia.
Św. Ambroży jest patronem Bolonii, Mediolanu i pszczelarzy.